Структурные основы активации танкиразы полимеризацией

Nature, том 612, страницы 162–169 (2022 г.) Процитировать эту статью

10 тысяч доступов

2 цитаты

207 Альтметрика

Подробности о метриках

Танкираза поли-АДФ-рибозилтрансферазы (TNKS, TNKS2) контролирует широкий спектр клеточных процессов, связанных с заболеванием, включая передачу сигналов WNT-β-катенина, поддержание длины теломер, передачу сигналов Hippo, восстановление повреждений ДНК и гомеостаз глюкозы1,2. Это стимулировало разработку ингибиторов танкиразы. Несмотря на это, наши знания о механизмах, контролирующих активность танкираз, остаются ограниченными. Как каталитические, так и некаталитические функции танкиразы зависят от ее нитевидной полимеризации3,4,5. Здесь мы сообщаем о реконструкции криоэлектронной микроскопии нити, образованной минимальной активной единицей танкиразы, включающей домен полимеризующегося стерильного альфа-мотива (SAM) и прилегающий к нему каталитический домен. Домен SAM образует новую антипараллельную двойную спираль, располагая выступающие каталитические домены для повторяющихся взаимодействий «голова к голове» и «хвост к хвосту». Головные взаимодействия высококонсервативны среди танкираз и вызывают аллостерическое переключение в активном центре каталитического домена, что способствует катализу. Хотя взаимодействия с хвостом оказывают ограниченное влияние на катализ, они существенны для функции танкиразы в передаче сигналов WNT-β-catenin. Эта работа раскрывает новый режим полимеризации домена SAM, иллюстрирует, как супрамолекулярная сборка контролирует каталитические и некаталитические функции, дает важную структурную информацию о регуляции независимой от ДНК поли-АДФ-рибозилтрансферазы и будет служить руководством для будущих усилий по модуляции танкиразы и расшифровать его вклад в механизмы заболевания.

Поли(АДФ-рибозил)ирование (ПАРилирование) представляет собой широко распространенную, но недостаточно изученную посттрансляционную модификацию, участвующую в широком спектре биологической активности6. Поли-АДФ-рибозилтрансферазы PARP1 и PARP2, индуцированные повреждением ДНК, являются терапевтическими мишенями при раке яичников, молочной железы, простаты и поджелудочной железы7. Хотя их регуляция достаточно хорошо изучена, регуляция двух других членов семейства, продуцирующих PAR, танкиразы 1 и танкиразы 2 (TNKS и TNKS2, соответственно; Fig. 1a), не является8,9. Процессы, регулируемые танкиразой, включают передачу сигналов WNT-β-catenin10, поддержание длины и сплоченности теломер11, передачу сигналов Hippo12, метаболизм глюкозы13, митоз14 и репарацию ДНК15. Эти функции стимулировали разработку ингибиторов танкиразы с потенциальной терапевтической пользой при раке, нейродегенерации, диабете и фиброзе16. Танкиразы собираются в спиральные нити посредством полимеризующегося SAM-домена3,4,5,17. Полимеризация танкиразы облегчает (1) связывание субстратов и (2) каталитическую активацию PARP4,5,18 и важна для функции танкиразы в передаче сигналов WNT-β-катенин, как посредством катализ-зависимых, так и катализ-независимых (каркасных) механизмов4, 5,18.

а, Доменная организация ТНКС и ТНКС2. б — крио-ЭМ-карты (до окончательного повышения резкости в Phenix для построения модели) TNKS2 SAM–PARP (слева) и после маскировки PARP (справа). Антипараллельные протофиламенты связаны друг с другом симметрией D1. А — акцепторный сайт; D, донорский участок. Желтые стрелки указывают полярность протофиламентов. c, Схематическое изображение структуры четвертичной нити с буквами, обозначающими разные протомеры (см. Расширенные данные, рис. 3j). г, Дополнительно уточненная крио-ЭМ-карта и модель одиночного протомера TNKS2 SAM-PARP. Домен PARP из PDB 5NWG33 наложен зеленым цветом, чтобы проиллюстрировать плохо разрешенные особенности сайта-акцептора. Подробности обработки данных см. на рис. 2 расширенных данных, а на рис. 3 расширенных данных — подробности карты и анализ мутации G1032WTNKS2.

Каким образом полимеризация танкиразы индуцирует ее активность PARP, остается неизвестным. Здесь мы описываем структуру 3 Å криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) полимерной минимальной активной единицы танкиразы, раскрывая новую двойную спиральную архитектуру, которая обеспечивает взаимные взаимодействия между доменами PARP для аллостерической активации танкиразы.

0.05). See Extended Data Fig. 9c,d for data from the +tankyrase inhibitor condition. g, Model for the activation of catalytic and non-catalytic tankyrase functions by polymerization. The dashed arrow indicates de-polymerization. Double-headed red arrows indicate interactions./p>monomeric); Fig. 5e and Extended Data Fig. 9a), in line with polymerization inhibition by auto-PARylation3. Additionally breaking SAM–SAM head-to-tail contacts (G1032WPARP Y920ASAM)4 resulted in nearly 100% monomers (Fig. 5e and Extended Data Fig. 9a). Although the PARP–PARP head combination mutant was just as catalytically impaired as G1032WPARP (see above), it appeared less polymeric (approximately 35% >monomeric), also than the wild-type protein, indicating that PARP–PARP head interactions contribute to polymerization. Note, however, that the studied species are probably dissociation products of larger polymers lost by dilution as PARP–PARP contacts are not expected to form in these very short filaments (see Discussion). The H1048AD-loop mutation conferred increased polymerization, comparable with G1032WPARP, suggesting that the associated reduction in catalytic activity is sufficient to favour polymerization (Fig. 5e and Extended Data Fig. 9a). Mutation of the interprotofilament contact (R896DSAM) and SAM/linker–PARP interface (on the SAM domain side) did not detectably reduce polymerization (Fig. 5e and Extended Data Fig. 9a). Variants containing combined PARP domain mutations in the PARP–PARP tail and SAM/linker–PARP interfaces appeared less monomeric, but presented with a higher tendency to stick to the glass surface, potentially due to aggregation, hindering reliable quantification (Extended Data Fig. 9a,b and Supplementary Video 1)./p>

monomeric events, with s.e.m., using Microsoft Excel for Mac (v16.57) and GraphPad Prism (v9.3.1). Note that the quantifications in Fig. 5e and Extended Data Fig. 9b show the percentages of particles that are monomeric or multimeric; this is distinct from the percentages of protein molecules in different assembly states (monomeric or >monomeric). For example, a mass photometry peak corresponding to dimers and of equal height to the monomer peak contains twice as many proteins./p>

monomeric species used for quantification. The three species marked with asterisks have poorer separation between peaks due to a higher tendency of molecules to repeatedly bind and unbind to and from the glass surface (see Methods for details). b, Analysis of mass photometry data for additional PARP domain mutant variants as in Fig. 5e (n = 5 independent experiments; individual data points and means; error bars, SEM). Data for controls (WT, G1032WPARP, G1032WPARP Y920ASAM) are identical to Fig. 5e and shown again for reference purposes. As for a, the three species marked with asterisks should be interpreted with caution. c, Fluorescence microscopy as in Fig. 5f, but after application of a tankyrase catalytic inhibitor. d, Quantification of c (n = 3 independent experiments; individual data points and means; error bars, SEM). e, Differential scanning fluorimetry of the indicated variants of His6-MBP-TNKS2 SAM-PARP. Data are means from three parallel technical replicates. f, g, Coomassie-stained SDS-PAGE gels of purified His6-MBP-TNKS2 SAM-PARP fusion proteins for quality control. Sufficiently high protein yield did not require repeated purifications for most of the variants (n = 1)./p>

Новости