Структурные основы липидной и медной регуляции АВС-транспортера MsbA

Nature Communications, том 13, номер статьи: 7291 (2022) Ссылаться на эту статью

2580 Доступов

2 цитаты

8 Альтметрика

Подробности о метриках

Важным этапом биогенеза липополисахаридов (ЛПС) является переворачивание липоолигосахарида, предшественника ЛПС, из цитоплазматического листка внутренней мембраны в периплазматический листок внутренней мембраны, операция, осуществляемая АТФ-связывающим кассетным транспортером MsbA. Хотя связывание ЛПС с внутренней полостью MsbA хорошо установлено, селективность взаимодействий MsbA с липидами в других сайтах остается плохо изученной. Здесь мы используем нативную масс-спектрометрию (МС) для характеристики взаимодействий MsbA-липидов и проведения структурных исследований. Мы показываем, что транспортер очищает совместно с медью (II), а связывание металла модулирует белок-липидные взаимодействия. Представлена ​​структура с разрешением 2,15 Å N-концевой области MsbA в комплексе с медью (II), демонстрирующая структуру, напоминающую пептид GHK, высокоаффинный хелатор меди (II). Наши результаты демонстрируют конформационно-зависимое сродство связывания липидов, особенно с предшественником ЛПС, 3-дезокси-D-манно-окт-2-улозоновой кислотой (Kdo)2-липид А (KDL). Мы сообщаем о структуре с разрешением 3,6 Å MsbA, захваченной в открытой, обращенной наружу конформации с аденозин-5'-дифосфатом и ванадатом, обнаруживая отдельный сайт связывания KDL, где липид образует обширные взаимодействия с переносчиком. Дополнительные исследования предоставили доказательства того, что внешний сайт связывания KDL консервативен и является положительным аллостерическим модулятором активности АТФазы, служащим механизмом прямой активации для сопряжения активности транспортера с биосинтезом ЛПС.

Определяющей особенностью большинства грамотрицательных бактерий является наличие липополисахарида (ЛПС) во внешнем листке внешней мембраны1,2,3. ЛПС способствует формированию непроницаемого барьера, который помогает бактериям противостоять антибиотикам и стрессам окружающей среды2. Биогенез ЛПС начинается в цитоплазме с продукции липоолигосахарида-предшественника ЛПС (LOS) с последующим организованным транспортом на поверхность клетки вместе с дальнейшими модификациями (рис. 1а)4. LOS содержит консервативный фрагмент липида А, бисфосфорилированный дисахарид глюкозамина (GlcN) с четырьмя-семью ацильными цепями, украшенный сахаром 3-дезокси-D-манно-окт-2-улозоновой кислоты (Kdo)1. Дальнейшее украшение включает присоединение основного олигосахарида, который варьируется у разных бактерий2. Цитоплазматический LOS переворачивается с внутреннего на периплазматический листок внутренней мембраны, что является важным шагом, выполняемым транспортером АТФ-связывающей кассеты (ABC) MsbA. Поскольку ингибирование или удаление MsbA летально5, этот транспортер стал привлекательной мишенью для разработки антибиотиков. Недавно были разработаны низкомолекулярные ингибиторы MsbA, которые различаются по способу действия, например, улавливают транспортер в конформации, обращенной внутрь (IF), или имитируют связывание субстрата6,7,8,9,10.

Биосинтез липополисахаридов начинается в цитоплазме с образованием липоолигосахаридов (LOS). LOS состоит из консервативной структуры липида А (серый), бисфосфорилированного дисахарида глюкозамина, модифицированного сахаром 3-дезокси-D-манно-окт-2-улозоновой кислоты (Kdo) (оранжевый) и сердцевинным олигосахаридом (фиолетовый), из которых зависит от бактерий. MsbA, приводимый в действие гидролизом АТФ, переворачивает цитоплазматический LOS с внутреннего листка внутренней мембраны на внешний, что является важным этапом биогенеза ЛПС. Перевернутый LOS транспортируется на внешнюю мембрану вместе с дополнительными модификациями и становится LPS. б Собственный масс-спектр оптимизированных образцов MsbA в C10E5 дает хорошо разрешенный масс-спектр. c Константы равновесной диссоциации (KD) для отдельных событий связывания липидов с частично загруженным MsbA. d Деконволюция масс-спектра показана на панели b. Разные молекулярные виды соответствуют димерному MsbA и разному количеству связанных ионов меди. e Измеренная масса MsbA после загрузки медью(II) показывает насыщение двух центров связывания. f KD для отдельных событий связывания липидов с MsbA, полностью загруженным медью (II). Приводятся среднее значение и стандартное отклонение (n = 3, биологические повторы). Исходные данные предоставляются в виде файла исходных данных.